Apre 25 jou enkubasyon estatik a 28°C, lakaz ki soti nan *Pleurotus ostreatus* NRC620 te montre pi gwo aktivite nan medyòm kilti chanpiyon an. Valè pH ak tanperati optimal pou anzim sa a te 3.0 ak 70°C, respektivman. Apre 2 èdtan enkubasyon a 40°C ak 50°C, aktivite anzim lan te kenbe 68.33% ak 59.61%, respektivman. Apre 2 èdtan enkubasyon nan yon tanpon sitrat-fosfat (pH 7.0), aktivite anzim lan te rete a 100%. Adisyon 10 mM MgSO₄ ak CuSO₄ te ogmante aktivite anzim lan apeprè 21% ak 35%, respektivman, pandan ke NaCl, MnCl₂, KCl, ak CaCl₂ te inibi aktivite anzim lan. Lè yo te itilize ABTS kòm yon substrat, paramèt sinetik yo (Km ak Vmax) lakaz *Pleurotus ostreatus* NRC 620 te 1.99 mM ak 16,217 μmol min−1 L−1, respektivman. Tretman anzimatik echantiyon ji pòm yo te redwi tou de pH ak viskozite anpil, e rediksyon sa a te korele avèk yon ogmantasyon nan tan depo. Tretman lakaz la te lakòz yon ti diminisyon nan kontni fenolik total ji pòm nan, men pa gen okenn rediksyon nan aktivite antioksidan ki te obsève.
Nan dènye ane sa yo, chèchè yo te konsantre sou aplikasyon byoteknoloji vèt nan endistri alimantè a. Lakaz se youn nan anzim ki pi itil nan endistri alimantè a, li jwenn aplikasyon nan domèn tankou pwosesis ji, boulanjri, estabilizasyon diven, ak amelyorasyon kalite organoleptik pwodwi alimantè yo.1Anpil plant siperyè ak mikwo-òganis sekrete lakaz,2epi chanpiyon tankou deuteromycetes, askomiset, ak basidiomycetes kapab pwodui lakaz tou.3Lakaz (EC 1.10.3.2) se yon oksidaz ble ki redwi oksijèn molekilè an dlo lè l sèvi avèk yon sistèm ki gen twa atòm kwiv diferan, kidonk okside divès konpoze fenolik ak amin aromatik. Pandan pwodiksyon ji fwi ak legim, mawonaj anzimatik ak nonanzimatik se pwoblèm kritik.4Piske sibstans sa yo afekte koulè, gou ak bon sant ji a negatifman, yo dwe retire yo.5
Nan tout fwi yo, pòm se fwi ki pi konsome atravè lemond ak nan Inyon Ewopeyen an. An 2019, pwodiksyon pòm te klase twazyèm nan lemonn, li te depase 87 milyon tòn.6Pòm gen anpil konpoze fenolik, tankou flavonoid ak asid fenolik tankou asid kafeyik ak asid klorojenik.7Paske ji pòm tipikman konsome nan fòm klè li, apeprè 50% a 90% nan konpozan fenolik yo pèdi pandan pwosesis filtraj la.8Jodi a, konsomatè yo gen tandans chwazi pwodwi ki pa trete anpil, tankou ji pòm twoub ki gen anpil polifenol. Sepandan, akòz gwo kantite fenolik li genyen, kalite ji pòm sa a patikilyèman sansib a dekolorasyon ak vin nwa.9Yo itilize plizyè teknoloji, tankou metòd tretman chalè tankou pasterizasyon nan 60–90°C, pou diminye oswa anpeche ji pòm vin nwa.10Sepandan, dapre rechèch Sauceda-Gálvez11, tretman tèmik ka detwi pwodui chimik temèt yo epi afekte kalite organoleptik ji pòm nan. Altènativ pou metòd tretman tèmik yo enkli diyoksid kabòn superkritik, radyasyon iltravyolèt, iltrason, presyon idrostatik ki wo, oswa omojènizasyon anba presyon ki wo.12Efikasite teknoloji sa yo ak rannman ji fwi ki apwopriye yo depann de paramèt yo itilize yo ak karakteristik pwodwi yo. Itilizasyon yo toupatou limite pa pri ki wo, efè negatif sou kalite kèk pwodwi alimantè, oswa inaktivasyon anzim ki pa adekwa.13,14
Yo ka itilize lakaz pou estabilize epi klarifye ji fwi.15Gökmen et al.16Yo rekòmande itilizasyon lakaz pou klarifikasyon ji fwi paske li retire konpoze fenolik yo efektivman lè li konvèti yo an polimè oswa oligomè ki fasil pou retire pa nenpòt manbràn ultrafiltrasyon, sa ki pèmèt ji pòm kenbe yon koulè ak yon klè ki estab pou jiska sis semèn nan 50°C. Lakaz *Trichoderma* pirifye a te imobilize sou pèl aliminyòm epi yo te itilize li pou retire konpoze ki gen move gou ki koze pa kontaminasyon mikwòb nan ji pòm.17
Apeprè 80-90% nan konpozan temèt ki nan ji pòm yo se estè ak aldeid, ki bay ji a yon bon sant inik.18Yo te imobilize lakaz ki soti nan *Trametes versicolor* sou yon sipò ki pa chè ki te fèt ak fib natirèl ki soti nan jèn kokiy kokoye pou klarifikasyon ji pòm.19Etid anvan yo te envestige estabilizasyon ji pòm (koulè ak twoubidite) lè l sèvi avèk metòd san anzim oswa imobilizasyon, oubyen an konbinezon avèk ultrafiltrasyon.5,19Sepandan, efè lakaz chanpiyon yo sou pwopriyete fizikochimik ji pòm pandan depo rete enkoni. Se poutèt sa, objektif etid sa a se te pou envestige eksperimantalman chanjman nan pwopriyete fizikochimik yo, kontni konpoze fenolik yo, ak aktivite antioksidan ji pòm apre tretman ak lakaz chanpiyon ak depo nan frijidè pandan de semèn. Lakaz yo gen kapasite pou okside konpoze fenolik yo, sa ki fè yo pwomèt pou itilize nan divès pwosesis endistriyèl, tankou klarifikasyon ji. Etid sa a te egzamine lakaz ki soti nan *Pleurotus ostreatus* NRC 620, konsantre sou kondisyon ideyal pou aktivite ak efikasite yo nan klarifikasyon ji. Pandan ke rechèch sou dyondyon zuit (P. ostreatus NRC 620) toujou limite, etid anvan yo te egzamine anzim ki soti nan divès sous chanpiyon, tankou Trametes versicolor ak Ganoderma lucidum. Objektif etid sa a se te pou evalye aplikasyon potansyèl anzim sa a nan endistri alimantè a epi mete aksan sou pwopriyete inik li yo, patikilyèman pH ak tanperati ideyal li yo.
Yo te achte 2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) nan men Sigma-Aldrich (Kanada). Tout lòt reyaktif yo te nan klas analitik.
Sant Koleksyon Kilti Mikwòb Sant Rechèch Nasyonal la te jwenn souch djondjon zuit NRC620 ki byen koni an. Apre soukilti a, yo te estoke souch sa a sou plak agar dekstròz pòmdetè a 4°C. Metòd preparasyon inokulum nan te jan sa a: yo te inokile miselyòm 10 jou ki te byen devlope sou plak agar dekstròz pòmdetè epi yo te enkube l a 28°C. Apre 10 jou, yo te retire twa blòk miselyòm 12 mm dyamèt nan medya agar la lè l sèvi avèk yon pwenson metal esteril epi yo te mete yo nan flakon Erlenmeyer 250 mL ak bouchon koton ki gen 50 mL medya kilti esterilize (pH 5.0, jan Othman et al. te dekri deja.20). Kilti yo te enkube a 28°C pandan 18 jou. Apre sa, yo te filtre kilti yo atravè papye filtè Whatman No 1, epi sipènatant ki te sòti a te sèvi kòm sous anzim lan.
Yo te detèmine aktivite lakaz la lè l sèvi avèk ABTS kòm yon substra. Melanj reyaksyon an (2 mL) te genyen 500 μL 0.3 mM ABTS (ki fonn nan 0.1 M tanpon sitrat sodyòm, pH 4.5) ak kantite echantiyon anzim ki nesesè a te dilye ak dlo distile.21,22Etandone lakaz ka okside ABTS nan tanperati chanm (28 °C ± 2), oksidasyon ABTS la te detèmine lè yo te mezire ogmantasyon absòbans lan nan 420 nm (ε420= 36,000 santimèt-1 M -1) lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV Agilent Carry-100. Yo te bezwen yon inite aktivite lakaz pou okside 1 μmol ABTS pa minit. Yo te detèmine konsantrasyon pwoteyin nan metòd Bradford la lè l sèvi avèk albumin serik bovin kòm yon kontwòl entèn.23,24
Apre yo te fin jwenn anzim nan souch dyondyon zuit NRC 620 la, yo te mezire aktivite li nan diferan entèval kiltivasyon pandan 25 jou anba kondisyon estatik a 28 °C.
Pou etidye efè tanperati sou aktivite lakaz, yo te fè eksperyans nan yon seri tanperati ant 20 ak 90 °C. Anvan yo te ajoute anzim nan epi yo te kòmanse reyaksyon an, yo te melanje tanpon an (0.1 M sitrat sodyòm, pH 4.5) ak substrat la (ABTS) epi yo te enkube yo pandan 5 minit nan divès tanperati. Yo te evalye estabilite tèmik anzim nan lè yo te enkube l nan yon tanpon fosfat sodyòm 0.05 M (pH 7.0) a 40, 50, 60, ak 70 °C pandan 2 èdtan, respektivman. Apre sa, yo te evalye aktivite rezidyèl la lè l sèvi avèk substrat ABTS la.
Yo te evalye efè pH sou aktivite lakaz la lè yo te itilize ABTS kòm yon substrat nan 0.1 M sitrat-fosfat tampon ak yon seri pH ant 2.5 ak 7.0. Yo te enkube solisyon anzim lan a 40°C pandan de zèdtan nan 0.1 M sitrat ak tampon Tris (pH 3, 4, 6, ak 7) pou evalye estabilite pH la. Yo te kalkile aktivite rezidyèl ak ABTS kòm yon substrat apre enkubasyon an.
Yo te enkube lakaz la pandan 10 minit nan yon tanpon fosfat sodyòm (0.05 M, pH 7.0) ki gen plizyè iyon metal (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, ak Mn2+) nan konsantrasyon 2.5 mM ak 10 mM, respektivman. Apre sa, yo te ajoute substrat la (ABTS) pou kòmanse reyaksyon an, epi yo te evalye aktivite relatif la.
Yo te mezire oksidasyon ABTS pa lakaz nan divès konsantrasyon (0.025–3 mM) nan pH 4.5 pou detèmine paramèt sinetik yo (Vmax ak Km). Paramèt sinetik yokonstanYo te kalkile konstan sinetik yo nan ekwasyon Michaelis-Menten an lè l sèvi avèk yon graf Lineweaver-Burk, ki trase resipwòk vitès reyaksyon an kòm yon fonksyon konsantrasyon substrat la. Yo te kalkile konstan sinetik yo apati graf Lineweaver-Burk la lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism vèsyon 6.01.
Apre yo te fin byen lave pòm yo ak dlo tiyo, yo te koupe yo an de epi yo te fè ji yo avèk yon ji pòm Braun MP80 otomatik (ki fèt an Almay). Yo te filtre ji a atravè kat kouch twal fwomaj. Yo pa t ajoute okenn anzim nan gwoup kontwòl la, alòske yo te ajoute 2.0% lakaz (konsantrasyon ki pi efikas yo te teste a) nan ji pòm ki fèk prepare a, epi yo te konsève ji a 4°C pandan de semèn.
Yo te detèmine asidite titrabl (TA) ak pH la dapre metòd Boulton et al.al.27Yo te mezire pH chak echantiyon avèk yon pH mèt dijital (JENWAY 3510 pH meter). Yo te kalkile asidite titrab (TA) a baze sou asid malik avèk fòmil sa a.
Kote V ak C se volim (mL) ak konsantrasyon (0.1 mol/L) solisyon idroksid sodyòm ki te itilize nan titrasyon an, respektivman. K se koyefisyan konvèsyon asid malik la, egal a 0.067, epi W se mas (g) ji pòm nan.
Total solid idrosolubl yo (TDSYo te detèmine kontni ) tout echantiyon ji yo lè l sèvi avèk yon refraktomèt pòch PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Japon). Apre chak mezi, yo te rense lantiy optik la avèk dlo deyonize, epi yo te teste chak echantiyon ji pòm twa fwa. Yo te kalkile valè pou chak echantiyon lè yo te pran mwayèn twa mezi yo. Yo te kalkile mwayèn ± devyasyon estanda pou chak echantiyon ji pòm tou lè yo te pran mwayèn rezilta sa yo.
Yo te evalye viskoelastisite echantiyon ji pòm yo lè l sèvi avèk yon viskozimèt wotasyonèl (RV, Rheotest 2, Almay). Yo te mete echantiyon an andedan silenn "S2" viskozimèt la. Viskozite aparan an te reprezante pa pant koub estrès tayisman an kont vitès tayisman an, ki te kalkile apati estrès tayisman an ak koub korespondan yo nan divès vitès tayisman (soti nan 1.00 rive nan 437.4 s⁻¹). Fòmil pou kalkile viskozite aparan an se jan sa a:
Kote η se viskozite aparan an (cP), τ se estrès tayisman an (dyn/cm²), γ se vitès tayisman an (sec⁻¹), epi (τ) kalkile lè l sèvi avèk valè koupl (α) ak silenn (Z) yo lè l sèvi avèk fòmil sa a: τ = Z . α.
Yo te detèmine endèks mawonaj la dapre metòd Meidav et al.al.29Yo te santrifije yon echantiyon ji 10 ml a 2750 xg pandan 10 minit. Yo te melanje 5 ml nan sipènatant ji a ak 5 ml etanòl 95%. Yo te mezire absòbans melanj lan a 420 nm avèk yon espektrofotomèt Shimadzu UV (UV-1601 PC).
Yo te detèmine kontni fenolik total la (TPC) pa kolorimetrik lè l sèvi avèk reyaktif Folin-Ciocalteu a jan Boulton et al. dekri sa.[27]. Yo te konstwi yon koub estanda asid galik pou konsantrasyon soti nan 0 a 500 mg/L (r²= 0.997). Rezilta yo eksprime kòm ekivalan asid galik (mg GAE/mL).
Ajoute 125 μL dlo distile ak 2850 μL solisyon FRAP nan 25 μL ji pòm epi kite melanj lan nan fènwa a pandan yon ti tan.30min. Apre sa, mezire absòbans lan nan 593 nm lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV Shimadzu (UV-1601 PC). Reyaktif FRAP la te prepare lè yo te melanje 300 mM tanpon asetat (pH 3.6), 20 mM klori fè(III), ak 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazin (TPTZ) (ki fonn nan 40 mM HCl) nan yon rapò 10:1:1. Yo te pwodui yon koub estanda lè l sèvi avèk Trolox kòm estanda a (R²= 0.999), epi rezilta yo eksprime kòm μM Trolox/mL.
Yo te detèmine aktivite antioksidan ji trete ak ji ki pa trete yo lè l sèvi avèk metòd DPPH la pou evalye kapasite yo pou elimine radikal lib DPPH yo.31Yo te melanje dis mikrolit ji ak 1 ml yon solisyon DPPH (100 μM) nan metanol. Apre reyaksyon nan fènwa pandan 30 minit, yo te mezire absòbans melanj lan nan 517 nm lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt Shimadzu UV (UV-1601 PC). Yo te eksprime rezilta yo kòm ekivalan trolox (μM trolox/ml) ki baze sou yon koub kalibrasyon (R2= 0.990).
Done yo jwenn yo montre ke yo te obsève pwodiksyon maksimòm lakaz nan dyondyon zuit NRC 620 yo nan fen 18yèm jou fèmantasyon an, rive nan yon aktivite 1302 U/L. Sa a te sèvi kòm baz pou detèmine tan kiltivasyon optimal pou pwodiksyon lakaz (Figi 1). Malgre ke pwodiksyon anzim lan te ogmante ak ogmantasyon tan kiltivasyon an, to ogmantasyon an pa t dirèkteman pwopòsyonèl ak tan kiltivasyon an; apre 21 jou, aktivite anzim lan te ogmante sèlman pa 90 U/L (pou rive nan 1390 U/L). Se poutèt sa, yo te finalman chwazi 18 jou kòm tan kiltivasyon optimal la pou balanse rannman pwodwi a ak benefis ekonomik ogmantasyon tan kiltivasyon an.
Efè tan kiltivasyon sou sede lakaz nan Pleurotus ostreatus NRC 620. Twa blòk miselyèl chanpiyon (12 mm) te inokile nan 50 ml medyòm esteril epi answit kiltive yo a 28 °C pandan diferan tan.
Ann akò ak lòt etid yo, rezilta nou yo endike ke peryòd kilti ideyal la pou reyalize pik sekresyon lakaz pa chanpiyon yo gen chans pou yo ant 7 ak 36 jou.32Dapre Ezike et al.33*Trametes polyzona* WRF03 te pwodui pi gwo kantite lakaz nan fen nevyèm jou fèmantasyon an, avèk yon aktivite espesifik 1637 U/mg pwoteyin. Anplis, Othman et al.34Yo te jwenn ke *Trichoderma harzianum* S7113 te sekrete yon gwo kantite lakaz nan senkyèm jou kilti a. To pwodiksyon lakaz la te rive nan yon pik aktivite nan katòzyèm jou a epi apre sa li te diminye piti piti.34Malgre ke sekresyon anzim kapab rive tou pandan faz kwasans prensipal la, li anjeneral rive nan pik li pandan faz entèmedyè a epi li deklanche pa konsomasyon yon sous kabòn oswa azòt.34,35
Malgre lakaz ki soti nan Pleurotus ostreatus NRC 620 la te montre yon gwo aktivite sou yon pakèt tanperati soti nan 50°C rive nan 80°C, li te prèske rive nan pik aktivite li (69–98%), aktivite maksimòm li te obsève a 70°C (Fig. 2a). An deyò de ranje tanperati sa a, aktivite anzim lan te diminye a apeprè 70°C. Rezilta sa yo sijere ke anzim lan aktif nan tanperati ki wo, pwobableman paske tanperati ki wo ogmante enèji sinetik reyaksyon an.
Efè tanperati reyaksyon (a) ak pH (b) sou aktivite lakaz nan *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Yo te rive nan tanperati ki varye ant 20 ak 90 °C lè yo te pre-enkube melanj lan nan diferan tanperati pandan 5 minit anvan yo te ajoute anzim lan epi yo te kòmanse reyaksyon an. Yo te evalye efè pH sou aktivite lakaz la lè l sèvi avèk ABTS kòm yon substrat nan solisyon ki gen 0.1 M sitrat-fosfat tampon sou yon seri pH ant 2.5 ak 7.0.
Dapre Ezike et al.al.33, tanperati optimal pou lakaz *Trametes polyzona* WRF03 la se 55 °C, ki se menm jan ak sa ki pou *Ganoderma lucidum*lakas36epi menm jan ak tanperati optimal la (50 °C) pou *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakaz . Baldrian38fè remake ke, menm jan ak lòt sistèm anzim ki degrade lignin, tanperati ideyal pou lakaz la se ant 50 ak 70 °C.
Rezilta yo te montre ke anzim nan te montre pi gwo aktivite a nan pH 3.0, rive nan 94% aktivite nan pH 3.5. Sepandan, li te rete aktif sou yon pakèt pH soti nan 2.5 a 7.0 (Figi 2b). Anplis de sa, li te montre pi gwo aktivite nan kondisyon asid konpare ak kondisyon net oswa alkalin. Aktivite li te rete omwen 77% sou seri pH soti nan 2.5 a 4.5, men li te sèlman rive apeprè 38% nan pH 7.0. pH optimal pou lakaz ki soti nan *Trametes polyzona* WRF03 te 4.533, ki se menm ak pH pou lakaz ki soti nan *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, ak *Trametes hirsuta* 41. Sepandan, dapre etid Chairin et al. la.42, pH optimal pou lakaz ki soti nan *Polymorpha f. sp.* WR710-1 se 2.2, alòske pH optimal pou lakaz ki soti nan *Polymorpha f. sp.* IBL-04 se 5.043. Lyezon anyon idroksid (inibitè lakaz) ak atòm kwiv lakaz T2/T3 a ka rezon pou aktivite lakaz ki diminye a anba kondisyon pH net oswa alkalin. Sa ka deranje transfè elektwon entèn ki soti nan sant T1 a rive nan sant T2/T3 a, kidonklimiteaktivite anzim lan23,44
Lè yo te enkube anzim nan nan diferan tanperati, yo te jwenn ke tou de tan enkubasyon an ak tanperati a te afekte estabilite anzim nan. Li enpòtan pou note ke lakaz ki soti nan *Trametes polyzona* NRC 620 te montre yon pi gwo estabilite nan 40℃ ak 50℃, li te kenbe 68.33% ak 59.61% nan aktivite inisyal li, respektivman, apre 120 minit (Figi 3a). Okontrè, nan menm kondisyon yo (40℃ ak 50℃, 120 minit), lakaz ki soti nan *Trametes polyzona* WRF03 te kenbe 64.38% ak 42.92% nan aktivite li, respektivman.33Okontrè, ogmantasyon tan ak tanperati enkubasyon an te diminye estabilite lakaz *Trametes polyzona* NRC 620 la; Apre enkubasyon nan 60℃ ak 70℃ pandan 60 minit, aktivite li te diminye a 39.24% ak 1.72%, respektivman (Figi 3a). An akò ak rezilta eksperimantal yo, lakaz ki soti nan *Trametes polyzona* WRF03 la te montre pi gwo estabilite nan 40 ak 50℃ pandan tout pwosesis tretman tèmik la.33Menm jan an tou, Lueangjaroenkit et al.al.37ak Chairin et al.al.42rapòte estabilite lakaz ki soti nan Trametes polyzona KURNW027 ak Trametes polyzona WR710-1 a 50 °C pandan 1 èdtan, respektivman. Kòm yon biokatalizè itil ki aplikab nan divès domèn byoteknolojik, lakaz ta dwe gen bon estabilite ak pèfòmans sou yon pakèt tanperati.
Estabilite tèmostatik (a) ak estabilite pH (b) lakaz ki soti nan *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Yo te evalye estabilite tèmostatik la lè yo te enkube solisyon anzim lan nan yon tanpon fosfat sodyòm 0.05 M (pH 7.0) a 40, 50, 60, ak 70 °C pandan 2 èdtan, respektivman. Yo te evalye estabilite pH la lè yo te enkube solisyon anzim lan nan yon tanpon sitrat 0.1 M ak yon tanpon Tris (pH 3, 4, 6, ak 7) a 40 °C pandan 2 èdtan. Yo te kalkile aktivite rezidyèl la lè yo te itilize ABTS kòm yon substra apre enkubasyon.
Pou detèmine kondisyon optimal pou itilizasyon ak depo anzim, nou te envestige efè pH sou estabilite lakaz la. Ekspozisyon a diferan valè pH te afekte anpil estabilite estrikti pwoteyin nan, kidonk enfliyanse estabilite ak aktivite molekil anzim nan. Rezilta yo te montre ke anzim nan te mwens estab anba kondisyon asid, alòske li te demontre pi bon estabilite nan valè pH ki pi wo (rejyon net ak alkalin). Nan valè pH 7.0, 6.0, 4.0, ak 3.0, to retansyon anzim apre 120 minit te apeprè 100%, 62.54%, 52.39%, ak 11.14%, respektivman (Fig. 3b). Lakaz *Strombus multisus* WRF03 te montre pi gwo estabilite nan valè pH net (5.5–6.5) ak pi ba estabilite nan valè pH asid (anba 4.0). Apre 120 minit nan valè pH 5.5, 6.0, ak 6.5, pousantaj retansyon anzim yo te apeprè 82%, 100%, ak 93% respektivman.33Khairin et al.42te note ke lakaz ki soti nan Trametes polyzona WR710-1 te estab nan yon seri pH ant 6.0 ak 7.0, pandan ke Sayed et al.45te montre ke lakaz te pi estab anba kondisyon pH net. Sepandan, lakaz ki soti nan Cerrena unicolor te montre estabilite tou anba kondisyon alkalin (pH 9.0).46Lakaz yo te etidye yo te montre yon gwo estabilite sou yon pakèt pH. Sa ka yon karakteristik enpòtan pou aplikasyon endistriyèl yo.
Piske gen kèk iyon metal ki gen efè estimilan ak inibitwa sou aktivite anzim, efè yo sou aktivite anzim yo dwe konsidere nan aplikasyon endistriyèl yo. Sa enpòtan paske iyon metal yo se kontaminan anviwònman komen ki ka afekte estabilite ak sentèz anzim ekstraselilè yo.47Pou nou te envestige efè plizyè iyon metal sou lakaz ki soti nan *Pleurotus ostreatus* NRC 620, nou te fè eksperyans korespondan yo. Jan Figi 4 la montre, selon kalite metal ki te itilize a, ogmantasyon konsantrasyon iyon metal la soti nan 2.5 mM pou rive nan 10 mM te afekte fonksyon anzim nan yon fason negatif. Pa egzanp,Mg²⁺ , Ko²⁺ , Zn²⁺, akCu²⁺te kapab estimile epi aktive aktivite anzim lan, pandan y apNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, akK⁺te kapab anpeche aktivite anzim lan. Nan yon konsantrasyon 10 mM, iyon Cu²⁺ ak Mg²⁺ yo te aktivatè aktivite lakaz ki pi puisan nan *Pleurotus ostreatus* NRC 620, bay yon degre aktivasyon apeprè 34% ak 20% respektivman. Sepandan, nan yon konsantrasyon 10 mM, iyon Ca²⁺ yo te inibitè lakaz ki pi puisan, diminye aktivite anzim lan apeprè 60%.
Efè iyon metal yo sou aktivite lakaz Pleurotus ostreatus NRC 620 la. Yo te enkube lakaz la pandan 10 minit nan yon tanpon fosfat sodyòm (0.05 M, pH 7.0) ki gen plizyè iyon metal nan konsantrasyon 2.5 mM ak 10 mM. Apre sa, yo te kòmanse reyaksyon an lè yo te ajoute substrat la (ABTS), apre sa yo te mezire aktivite relatif la.
Rezilta nou yo konsistan avèk sa lòt otè yo te jwenn ke Mg²⁺ ak Cu²⁺ amelyore aktivite *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ te jwenn ke lakaz ki soti nan *Xylaria* sp. stimule nan yon sèten mezi pa iyon kwiv (Cu²⁺). Anplis de sa, Foroutanfar et al.⁴⁹ ak Si et al.⁵⁰ te fè etid menm jan an sou lakaz ki soti nan *Paraconiothyrium variabile* ak *Trametes pubescens*, respektivman. Sit lyezon kwiv tip II (T2) anzim sa a ka satire ak Cu²⁺ nan yon konsantrasyon bay, sa ki ka eksplike estimilasyon aktivite lakaz nan pi gwo konsantrasyon Cu²⁺³⁹. Piske lakaz chanpiyon pouri blan yo se oksidaz ki gen plizyè atòm kwiv, efè iyon kwiv yo sou aktivite lakaz yo divès epi yo varye ant estimilan ak inibitwa rive nan net.⁵¹ Okontrè, Zhou et al.[52]rapòte keCu²⁺te inibi aktivite lakaz tèmit souteren Taiwan an (Odontotermes formosanus). Sepandan, lakaz Cerena sp. HYB07[53]ak Clitocybe maxima[54]pa te afekte pa iyon kwiv yo.
Espesifikasyon substrat la te reprezante pa paramèt sinetik li yo (Km ak Vmax); plis afinite lyezon substrat la ak anzim lan fò, se plis valè Km lan ba epi se plis espesifikasyon substrat la wo.3,21,55Yo te detèmine paramèt sinetik yo (Km ak Vmax) lakaz ki soti nan *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lè yo te itilize lojisyèl GraphPad Prism 6.0 la lè yo te trase graf Lineweaver-Burk la (Figi 5). Lè yo te itilize ABTS kòm yon substra, rezilta yo te 1.99 mM ak 16217 μmol.minit⁻¹ L⁻¹,respektivman. Elsayed et al.21rapòte ke valè Km pou oksidasyon ABTS yo te 0.1 mM ak 0.064 mM respektivman, sa ki endike yon gwo afinite izoanzim Lac A ak Lac B pou ABTS. Anplis de sa, valè Vmax yo te 0.182 μmolminit⁻¹ak 0.603 μmolminit⁻¹, respektivman. Valè Km ki te jwenn nan te pi ba pase sa ki te jwenn nan Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM); anplis, valè Vmax yo (1429 mmol min⁻¹) te toupi balè w ap itilize ABTS kòm yon substrat.33 Menm jan an tou, valè Km konsantrasyon lakaz Lentinus squarrosulus MR13 ak Trametes sp. AH28-2 yo te 0.0714 mM ak 0.025 mM, respektivman, epi valè Vmax yo te 0.0091 mM min−1 ak 0.67 mM min−1 mg−1 (an relasyon ak ABTS), respektivman.56,57
Yo te envestige efè konsantrasyon ABTS sou aktivite lakaz ki soti nan *Pleurotus ostreatus* NRC 620, epi yo te trase yon graf Lineweaver-Burk ki reprezante resipwòk vitès reyaksyon inisyal la an fonksyon de konsantrasyon ABTS. Yo te mezire reyaksyon oksidasyon ABTS la ak diferan konsantrasyon (0.025–3.0 mM) lakaz nan pH 4.5 pou detèmine paramèt sinetik yo (Vmax ak Km). Yo te kalkile konstan sinetik Michaelis-Menten yo lè l sèvi avèk graf Lineweaver-Burk ki reprezante resipwòk vitès reyaksyon an an fonksyon de konsantrasyon substrat la. Yo te kalkile konstan sinetik yo apati graf Lineweaver-Burk la lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism 6.01.
Anzim klarifikasyon tradisyonèl yo, tankou pektinaz yo, idrolize sibstans pektik yo, sa ki diminye viskozite ak twoubidite. Yo kraze polisakarid estriktirèl yo efektivman epi yo souvan itilize yo an konbinezon ak lòt anzim, tankou selilaz ak emiselilaz, pou amelyore sede ak klète. Sepandan, pektinaz yo pa vize espesyalman konpoze fenolik yo, ki se prensipal kontribitè nan twoubidite ak mawonaj oksidatif, patikilyèman nan ji tankou ji pòm ak ji rezen.58Okontrè, lakaz yo katalize oksidasyon konpoze fenolik yo, polimerize yo an molekil ki pi gwo, ensolubl, ke yo ka retire pa sedimantasyon oswa filtrasyon. Mekanis sa a pa sèlman amelyore klète, men tou li pwolonje dire lavi ji a lè li diminye chans pou li vin mawon pa oksidasyon ki koze pa konpoze fenolik yo. Anplis de sa, pwosesis klarifikasyon ki baze sou lakaz yo ka fèt anba kondisyon pwosesis modere (pH 3.5–5.5, tanperati 25–40 °C), sa ki fè yo apwopriye pou ji delika san yo pa konpwomèt pwopriyete nitrisyonèl oswa organoleptik yo.59Etid yo montre ke tretman pektinaz ka klarifye ji an 1-2 èdtan, alòske tretman lakaz tipikman mande yon tan reyaksyon ki pi long (3-6 èdtan) pou redwi konpoze fenolik yo nèt. Sepandan, pwosesis sa a ka optimize lè yo imobilize anzim nan oswa lè yo konbine lakaz ak metòd klarifikasyon mekanik.60Nan etid sa a, pwofilaj anzim ekstrè brit la te revele aktivite lakaz ak α-amilaz siyifikatif, alòske aktivite pektinaz ak ksilanaz yo te trè ba, epi yo pa t detekte aktivite selulaz. Se poutèt sa, rediksyon nan turbidite ak kontni fenolik la te sitou akòz aksyon lakaz la, alòske chanjman nan viskozite a te kapab an pati akòz aksyon amilaz la.
Tablo 1 an montre paramèt fizikochimik ji pòm ki fèk prese ak echantiyon ki trete ak lakaz. Rezilta yo montre ke rannman ji pòm ki fèk prese a (71.59%) te pi ba pase sa ki te nan echantiyon ki trete ak lakaz (87.34%). Rezilta sa yo konsistan avèk rezilta Pilnik ak Orange yo.61, ki te endike ke itilizasyon anzim nan pwosesis fwi ka ogmante rannman ji, amelyore filtraj, epi jwenn ji klè ak kalite siperyè pou konsantrasyon. Ogmantasyon nan rannman ji a se sitou akòz ogmantasyon nan kontni sik idrosolubl nan ji a. Pandan idwoliz anzimatik fwi yo, mezoglea ak pektin nan mi selilè pwodwi a detwi epi konvèti an sibstans idrosolubl tankou sik net ak asid.62.Valè pH ji pòm trete ak anzim nan te siyifikativman pi ba pase sa gwoup kontwòl la (P < 0.05), epi valè pH tou de gwoup yo te ogmante anpil pandan depo (Tablo 1). Rezilta sa yo konsistan avèk sa yo ki nan Mark et al.63, ki te note ke pH ji fwi kajou a te diminye apre depo apre tretman chalè. Degradasyon pektin ak fòmasyon asid galakturonik apre tretman anzim ka responsab ogmantasyon pH la pandan depo. pH echantiyon trete ak anzim yo te rete ant 4.05 ak 4.31 pandan tout depo a, alòske pH ji pòm ki pa trete a te varye ant 4.12 ak 4.33.
Asidite total (TA) echantiyon ki pa trete yo ak echantiyon ki trete ak lakaz yo te montre yon tandans diminisyon avèk ogmantasyon tan depo a (Tablo 1). Diminisyon asidite a te atribiye a konvèsyon asid òganik an idrat kabòn oswa reyaksyon anzimatik, ansanm ak oksidasyon pandan depo ji a.64Asidite total ji pòm kontwòl la ak echantiyon trete ak anzim yo te pi ba pase sa lòt ji yo (ji frèz 0.9%, ji prin 2.2%, ji kumquat 1.0%, ji abriko 2.4%, ji zoranj 0.8%), men sanble ak sa lòt ji yo (pa egzanp, ji pwa 0.3%).62Diferans sa yo nan ji pòm fre prese ki pa trete ka akòz plizyè faktè tankou kondisyon kwasans, faktè jenetik, nivo matirite, ak metòd pwosesis.65Diminisyon nan asidite total ji pòm kontwòl la ak ji pòm trete ak lakaz la konsistan avèk rezilta Singh et al. prezante yo.66konsènan diminisyon nan asidite total ji pòm Jin Nuo apre 74 jou depo. Nan lòt men an, Oshmiansky ak Wojdylo67pa t jwenn okenn chanjman siyifikatif nan asidite ji pòm lè yo t ap etidye efè metòd klarifikasyon tradisyonèl yo.
Rezilta yo prezante nan Tablo 1 endike ke valè total solid idrosolubl (TSS) nan ji pòm trete ak lakaz la te pi wo pase sa ki nan echantiyon ki pa trete a. Rezilta sa yo konsistan avèk etid pibliye yo.. 68Anplis, Tablo 1 montre ke valè TSS gwoup ji pòm kontwòl la te 9.58 nan premye moman an epi li te rive nan 11.05 nan fen peryòd depo a. Valè sa yo pi ba pase valè TSS ji pòm fre ke Hamid et al. te rapòte.. 69(11.2 ak 11.80, respektivman). Valè TSS echantiyon ji pòm trete ak lakaz yo te ogmante anpil, kòmanse soti nan 11.23 epi rive nan 12.93 apre de semèn depo nan 4°C (Tablo 1). Yo te obsève yon ogmantasyon menm jan an nan TSS pandan depo nan fwi Citrus, sitwon, ak zoranj dous. Ogmantasyon nan solid total idrosolubl (TSS) pandan depo a ka akòz idwoliz polisakarid (lanmidon) an monosakarid (sik), ogmantasyon nan konsantrasyon akòz dezidratasyon ji a, ak degradasyon pektin nan ji a an solid idrosolubl. Ogmantasyon nan solid total idrosolubl (TSS) a gen anpil chans akòz ogmantasyon nan sik idrosolubl yo, ki ka fòme pa konvèsyon pektin oswa seluloz an sik idrosolubl pa pektin oswa selulaz, respektivman, oswa pa idwoliz lanmidon an sik, jan Hamed et al. te rapòte sa.69.Yo ka obsève efè lakaz sou pwopriyete ji pòm nan vizyèlman, paske ji pòm trete ak lakaz la montre yon pi bon koule ak yon viskozite ki pi ba pase ji ki pa trete a. Obsèvasyon sa a anrejistre nan Tablo 1; Viskozite echantiyon trete ak anzim nan te 1.87 cP, alòske viskozite echantiyon kontwòl la te 2.95 cP. Diminisyon siyifikatif sa a nan viskozite a pwobableman akòz pi gwo kapasite kenbe dlo sibstans ki sanble ak pektin yo ak fòmasyon yon estrikti rezo kowèsif.
Nan etid sa a, yo te envestige efè lakaz sou endèks mawonaj (BI) ji pòm nan lè yo te mezire absòbans lan nan 420 nm avèk yon espektrofotomèt. Rezilta yo montre nan Tablo 1. Pandan depo a, BI echantiyon ji pòm yo nan tou de gwoup trete yo ak gwoup ki pa trete yo te montre yon tandans ogmantasyon gradyèl. BI a reflete degre mawonaj la epi li ka sèvi kòmyon enpòtanendikatè reyaksyon mawonman anzimatik ak non-anzimatik. Absòbans lan ogmante anpil pandan depo a (P < 0.05). Nan fen depo a, laA420Valè echantiyon ji pòm nan gwoup kontwòl la ak gwoup trete ak anzim yo ogmante apeprè 217% ak 121% respektivman (Tablo 1). Rezilta yo endike ke tretman anzim lan ka efektivman diminye degre mawonaj la apeprè 56%. Rezilta Bezerra et al. yo[19] yo konsistan avèk rezilta nou yo; Yo te itilize lakaz-glutaraldeyid-fib kokoye pou klarifye ji pòm, sa ki te diminye koulè orijinal li a pa 61%.
Malgre ke polifenol ki nan ji fwi yo gen efè nitrisyonèl ak terapetik pozitif sou kò imen an, yo kapab reyaji tou avèk pwoteyin yo, sa ki lakòz ji a vin twoub, sedimantasyon, oswa labouyi, kidonk chanje gou ak bon sant pwodwi a epi diminye dire lavi etajè li.71Objektif etid sa a se te pou diminye san danje kontni konpoze fenolik ki nan ji pòm lè l sèvi avèk lakaz ki soti nan Pleurotus ostreatus NRC 620. Rezilta yo prezante nan Tablo 1 montre ke kontni total konpoze fenolik ki nan ji pòm trete ak lakaz te redwi anpil anvan depo a 4 °C. Anplis de sa, kontni total konpoze fenolik la te diminye tou pandan depo nan tou de echantiyon yo te etidye yo (Tablo 1). Rechèch Sandri et al. te fè.72te montre ke ji pòm trete ak anzim ka kenbe aktivite antioksidan li ak kontni konpoze fenolik li. Sepandan, rezilta yon etid pa Lettera et al.73montre ke tretman ji zoranj ak lakaz fonjik ka diminye kontni konpoze fenolik ladan l jiska 45%.
Konpoze fenolik yo te demontre ke yo gen pwopriyete tankou eliminasyon radikal lib, rediksyon ak etenn oksijèn singlet, transfè atòm idwojèn, ak donasyon elektwon bay radikal lib, sa ki fè yo antioksidan pwisan.74Se poutèt sa, nan etid sa a, metòd ki baze sou DPPH ak FRAP yo te itilize pou evalye efè lakaz sou aktivite antioksidan ji pòm ki estoke nan frijidè pandan 14 jou (Tablo 2). Toulede metòd yo te montre yon ogmantasyon nan aktivite antioksidan pandan depo, ki ka akòz ogmantasyon konpoze fenolik lib yo oswa fòmasyon pwodwi reyaksyon Maillard (MRP), ak pwodwi reyaksyon Maillard yo pwobableman kòz ogmantasyon nan aktivite antioksidan an.75Reyaksyon mawonaj ki pa anzimatik (tankou degradasyon asid ascorbic, reyaksyon Maillard, ak degradasyon sik katalize pa asid) pwodui pigman mawon (melanoidin). Pwodui degradasyon asid ascorbic entèmedyè ak pwodui degradasyon sik (tankou konpoze kabonil) ka reyaji avèk asid amine atravè reyaksyon Maillard.76Malgre ke yo te etidye anpil kijan fwi ak legim vin mawon pandan depo, konpreyansyon nou sou reyaksyon sa yo rete limite.77Konpare ak metòd FRAP la, ji pòm trete ak lakaz la te montre yon aktivite antioksidan siyifikativman pi ba avèk metòd DPPH la (Tablo 2), epi aktivite antioksidan tout echantiyon yo te ogmante anpil avèk ogmantasyon tan depo a. Yo te itilize de metòd diferan pou detèmine aktivite antioksidan nan etid sa a paske prensip yo diferan. Metòd DPPH la mezire kapasite pou netralize radikal lib yo, alòske metòd FRAP la mezire kapasite pou diminye iyon fè yo. Se poutèt sa, li rekòmande pou itilize plizyè metòd pou detèmine aktivite antioksidan pou pi byen konprann aktivite antioksidan echantiyon yo etidye yo.78
Youn nan rezilta kle nan etid sa a se ke lakaz *Pleurotus ostreatus* NRC 620 montre aktivite optimal nan 70°C ak pH 3.0. Konpare ak lòt lakaz chanpiyon yo souvan itilize pou klarifikasyon ji, tankou lakaz *Trametes versicolor* ak *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 montre pi gwo estabilite tèmik ak yon pH pi asid. Lakaz ki soti nan *Trametes versicolor* ak *Ganoderma lucidum* tipikman montre aktivite optimal nan seri 50-60°C ak nan valè pH ant 3.5 ak 5.0. Diferans sa a ka kontribye nan amelyorasyon efikasite klarifikasyon ji, espesyalman pou ji asid kote estabilite nan valè pH ki pi ba yo enpòtan. Karakteristik inik *P. Konpare ak lòt lakaz chanpiyon etidye yo, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 montre kapasite pou fonksyone efektivman nan kondisyon ki pi difisil. Tanperati aktivite optimal li ki pi wo a sijere avantaj potansyèl nan aplikasyon endistriyèl, tankou vitès reyaksyon ki pi rapid ak kontaminasyon mikwòb ki redwi. pH ki ba li a, ki byen adapte ak nati asid anpil ji, ka itil nan pwosesis klarifikasyon ji. Rezilta sa yo jistifye plis eksplorasyon pou aplikasyon sou gwo echèl, sa ki fè *Pleurotus ostreatus* NRC 620 yon altènatif solid pou sous lakaz chanpiyon tradisyonèl yo. Konpare ak etid anvan yo, nou te jwenn ke tanperati optimal la se 60°C epi pH optimal la se 3.0. Apre reyaksyon a 60°C pandan 80 minit, lakaz *Ganoderma lucidum* te rete...46% nan aktivite li yo.79 Dapre Kurniawati ak Nicelle80Anzim *Ganoderma lucidum* yo montre yon estabilite ekselan pou rive modere nan 25°C ak valè pH ki varye ant 5.0 ak 8.0, epi estabilite nan pH 6.0 ak tanperati ki varye ant 10 ak 30°C. Nan etid sa a, nou te jwenn ke pH ak tanperati optimal pou aktivite anzim pou *Pleurotus ostreatus* te 3.0 ak 70°C, respektivman. Apre enkubasyon nan 40°C ak 50°C pandan de zè de tan, anzim nan te kenbe 68.33% ak 59.61% nan aktivite li, respektivman. Anplis de sa, lakaz Pleurotus ostreatus NRC 620 te montre yon aktivite ki wo sou yon pakèt tanperati soti nan 50°C a 80°C, prèske rive nan aktivite maksimòm (69%–98%), ak aktivite maksimòm obsève nan 70°C.
An konklizyon, lakaz djondjon zuit NRC620, ki te jwenn nan kondisyon estatik, te demontre yon aktivite ak yon estabilite optimal nan yon seri kondisyon pH ak tanperati, sa ki montre yon estabilite siperyè konpare ak lòt sous anzim yo. Adisyon 10 mM MgSO₄ ak CuSO₄ te ogmante aktivite anzim nan apeprè 21% ak 35% respektivman. Lè yo te trete l an ji pòm, anzim nan te redwi pH ak viskozite, alòske kontni fenolik la te diminye yon ti kras sèlman pandan depo.
Rezilta yo konfime potansyèl lakaz nan endistri alimantè a, patikilyèman nan klarifikasyon bwason. Lè li kraze espesyalman konpoze fenolik yo, lakaz pa sèlman diminye turbidite epi amelyore klète, men tou li kenbe kalite ji fwi yo anba kondisyon operasyon modere. Kontrèman ak ajan klarifikasyon tradisyonèl yo tankou jelatin, bentonit, ak jèl silica, lakaz pa jenere dechè oswa retire bon sant nan bwason yo, sa ki fè li yon opsyon ki pi respekte anviwònman an ak dirab. Anplis de sa, konpare ak lòt anzim ak metòd filtraj, lakaz ofri yon solisyon siblé ak pri-efikas san konpwomèt kalite pwodwi a.
Kyomuhimbo, HD ak Brink, HG. Aplikasyon ak estrateji imobilizasyon lakaz ki gen kwiv; yon revizyon. Heliyon 9, e13156 (2023).
Dat piblikasyon: 15 Desanm 2025